第一題 空白對照是否必須要做？

答：是的，空白對照組，即未處理對照組，是用于評估菌株自發回復突變菌落數量；另外，和陽性對照組結合用于試驗結果有效性的判定。

第二題 實驗中，會出現加 s9比減 s9菌落總數長得少/多，是什么原因？

答：（1）加S9組比減S9組菌落數少，有可能是S9代謝活化系統中有誘導性殘留，并且誘導劑具有一定的細菌毒性。

    （2）加S9組比減S9組菌落數多，這種情況屬正常現象，但即使偏高也會在國標或導則的要求范圍內；可能是因為肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可為菌株提供營養。

第三題 實驗時，用蒸餾水和純化水有區別嗎？

答：國標中是使用蒸餾水進行培養基的配制，我們也是遵循國標的要求，暫未對比過蒸餾水和純化水的區別。

第四題 s9中會有誘導劑殘留嗎？

答：我司誘導S9制備后會進行無菌鑒定、蛋白濃度測定、酶活測定、Ames試驗鑒定等，結果均符合要求，暫未檢測過是否有誘導劑殘留。

第五題 預實驗中細菌回復突變菌落數減少多少，算有細菌毒性？

答：（1）回復突變菌落數與溶劑對照組相比，減少50%以上，且具有劑量效應關系；

（2）與溶劑對照組相比，背景菌苔顯著減少或消失；

（3）當化合物細胞毒性極大時(背景菌苔完-全消失)，在高劑量組中可能會出現數量眾多的針尖樣菌落。這些針尖樣菌落不是回復突變菌落，該平皿不應計數。

第六題 試驗組中 SD 值過大一般是什么原因導致的？

答：三次平行重復間SD值過大可能由操作誤差、樣本處理不均（菌液、S9、受試物或標準誘變劑）、平板計數誤差等因素引起，我們在進行試驗時需確保所有平行樣品的處理步驟（如加樣體積、反應時間、溫度控制等）完-全一致，樣本需混合均勻，這樣能避免三次平行重復間的SD值過大。

第七題 加入 s9之后菌落不生長是什么原因？

答：如果其他不加S9組的菌落數正常，加S9組菌落不生長，有可能是S9中殘留的誘導劑對于細菌具有毒性。

第八題 標準中規定用十的九次方的菌液進行實驗，如何確定菌液濃度是十的九次方？

答：一般采用測定菌液在600nm處的吸光度值（OD600）和平板計數法結合來測定菌液的濃度。

第九題 預實驗背景菌臺無變化，回復突變數減少是否可以算是細菌毒性？

答：是的，如果回復突變菌落數與溶劑對照組相比，減少50%以上，且具有劑量效應關系，則表面受試物是具有細菌毒性的。

第十題 Ta98在擴增凍存后變得不穩定，有一層白色背景，影響菌落計數，是什么原因？

答： 我們暫時沒有遇到過該情況，您可以查一下相關的資料，我們也同其他客戶溝通一下，看看其他客戶有沒有遇到過類似的情況。

十一題 為何Pm101菌株，菌落數做的時候有的時候大有的時候小？

答：我們也遇到過類似的情況，PKM101的菌落體積大小不一致，這是正常的，只要菌落數在國標或者導則要求范圍內就可以。

十二題 陽性物自發回變數少是什么原因？

答：陽性對照組細菌回復突變菌落數少，有可能的原因是：（1）陽性底物溶解不徹-底或未充分混勻；（2）陽性底物添加量偏少；（3）試劑盒保存條件不合適或過期，標準誘變劑降解或 S9失活；（4）操作過程中添加菌液時頂層培養基溫度過高。

十三題 預孵化體系和平板摻入法所用的陽性藥物是否有區別？

答：沒有區別，二者所用的陽性藥物是一樣的。

十四題 要開展Ames試驗，如何選擇溶媒/賦形劑？

答：不同劑量濃度樣品的制備是開展Ames試驗的前提，制備符合試驗要求的樣品也有一些行業要求需要遵守。第一,溶媒/賦形劑的選擇原則是其不與受試物發生反應，對菌株和S9沒有毒性，沒有誘變性；第二，首-選蒸餾水，對于不溶于水的受試物可選擇其它溶媒/賦形劑，若受試物對水不穩定，應選用不含水的有機溶劑或賦形劑；第三，若選用有機溶劑作為溶媒，首-選DMSO，也可選其它溶媒，若選用的是不常用的溶媒或賦形劑，應有資料說明其理由，且若選用有機溶劑做為溶媒，每平板最高添加量不超過0.1mL。

十五題 Ames試驗的最高劑量組應如何確定？

答：Ames試驗最高劑量組的確定取決于受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。建議先進行預實驗測定受試樣品的毒性和溶解度，應根據受試樣品對細菌的毒性和在配制的最終混合物種的溶解度確定受試樣品的最高劑量組。可將回變菌落數的減少、背景菌苔體積變小或處理后細菌存活率降低等作為細菌毒性的指征。

十六題 Ames試驗組別如何設置？

答：Ames試驗通常需要包含未處理對照組（自發對照組）、陽性對照組（標準誘變劑對照組）溶媒對照組和樣品劑量組四個組別的試驗。需要注意的是，若溶解樣品使用的溶媒和標準誘變劑使用的溶媒不一致時，還需加做DMSO的對照，且樣品劑量組數量不同領域的要求會存在一定差異，需關注具體參照的標準或導則。

十七題 為什么要在有和沒有代謝活化系統的情況下試驗？

答：代謝活化系統是誘導S9和輔因子的混合溶液。誘導S9本身是經藥物誘導后的動物肝臟的組分，誘導的目的是讓酶活得以放大。加代謝活化系統組評估的是代謝產物的遺傳毒性，而不加代謝活化系統組評估的是原藥的遺傳毒性。對于未知化合物，因不確定是其自身，還是其代謝產物會有遺傳毒性，故需在這兩種情況下同時進行試驗。

十八題 Ames試劑盒可以檢測幾個樣品？

答：Ames試劑盒可完成一個樣品的Ames檢測。Ames試劑盒（5菌版/正式試驗）規格為250皿/盒，可在有和無代謝活化系統、5個菌株、三個平行的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測；Ames試劑盒（2菌版/預實驗）規格為150皿/盒，可在有和無代謝活化系統、2個菌株、三個平行的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的8個劑量組的遺傳毒性檢測；微量波動Ames試劑盒的規格我96孔*16板，可在有和無代謝活化系統、2個菌株、48孔/處理組的情況下進行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測。

十九題 試劑盒中菌株可不可以傳代培養？

答：不建議對試劑盒中的菌株進行傳代培養。原因主要有以下三點：第一，Ames試劑盒中菌株是以凍存菌液形式提供，可滿足Ames試驗要求，收到貨后無需進行其它處理，可直接用于試驗；第二，因Ames試劑盒中菌株均為營養缺陷型菌株，頻繁處理可能使得其某些特性丟失；第三，Ames試驗對菌株不但有濃度的要求，而且有自發和陽性突變菌落數的要求，國標或指導原則中雖然寫的較為簡單，但真正要達到其要求卻很難。

二十題 Ames試劑盒是否可分多次去使用？

答：Ames試劑盒試劑盒中菌株和S9復合物不建議反復凍融使用，如需分次多次試驗，建議按照菌株分次進行。Ames試劑盒中菌株為營養缺陷型菌株，且以凍存菌液形式提供，反復凍融一方面可能會導致其某些特性丟失，另一方面也會直接導致自發回變數和陽性誘變劑回變數達不到標準或指導原則要求。S9復合物在Ames試驗中是作為代謝活化系統，而發生代謝主要是酶的參與，反復凍融會導致酶活降低，可能會導致試驗結果的假陰性。

二十一題 當受試物（如某些抗生素）對細菌有高毒性時是否還需進行Ames試驗？有沒有其它驗證方法？

答：當受試物對細菌有高毒性時，仍應進行Ames試驗，因為致突變性可能出現在較低的、毒性較小的濃度。為了減少具有潛在遺傳毒性的化合物產生假陰性結果的風險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合。任何一項遺傳毒性試驗中的陽性結果并不一定能說明化合物對人類真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。故可以加做其它試驗，如基因突變試驗、染色體畸變試驗。

二十二題 在實驗的過程中，可能會因為化合物的溶解性不好，導致無法區分是菌落還是沉淀，該如何處理？

答：常規的要求是平皿中可以有未溶解的化合物，但是沉淀的存在不能影響到菌落計數。若這種情況無法避免，可以培養48h后先進行一次菌落觀察和計數，并繼續培養至72h，若生長則可判定為菌落，也可挑取菌落接種至培養基培養觀察是否生長。

二十三題 試驗過程中加S9組比不加S9組菌落數要高，是否正常？

答：這種情況屬正常現象，但即使偏高也會在國標或導則的要求范圍內。可能是因為肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可為會菌提供營養。

二十四題 受試物濃度低未檢出遺傳毒性還是本身無遺傳毒性？該如何判斷？

答：一方面，Ames試驗的要求是，若試驗結果為陰性，需進行驗證，即需改變試驗條件進行重復試驗。另一方面，為了減少假陰性結果的風險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合，可補做基因突變、染色體畸變、微核等其它試驗。

二十五題 醫療器械：浸提溶劑為什么選擇水？按照標準應該選擇生理鹽水或DMSO。

答：關于醫療器械的浸提屬于樣品前處理的過程，試劑盒中未提供，需自行進行準備。試劑盒適用于多個領域的Ames檢測，具體到每個領域，可能會有一定差異。

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